Генетика и разведение животных, 2020, № 1, С. 15-21


https://doi.org/10.31043/2410-2733-2020-1-15-21
УДК 636.2.57.089.38

Работа проведена в рамках выполнения фундаментальных научных исследований Министерства науки и высшего образования РФ по теме №АААА-А18-118021590132-9


КОМПЕТЕНТНОСТЬ К ИНДУЦИРОВАННОМУ ПАРТЕНОГЕНЕЗУ ООЦИТОВ BOS TAURUS В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ФУНКЦИОНАЛЬНОГО СТАТУСА ГАМЕТЫ И ЕЕ ПРОИСХОЖДЕНИЯ (ДИАМЕТРА ФОЛЛИКУЛА)

Т. И. КУЗЬМИНА 1, Х. АЛЬМ 2

Аннотация. Разработка эффективных методов получения партеногенетических зародышей в настоящее время рассматривается в новом ракурсе, как перспективная технология для создания гомозиготных линий эмбриональных стволовых клеток, генетически идентичных особей млекопитающих, а партеногенетические зародыши животных разных видов используют в качестве  модели для изучения механизмов импринтинга. В настоящем исследовании партеногенетические зародыши Bos Taurus получали индукцией холодовым шоком (экспозиция 20 минут при температуре – 0-(-4о)С) ооцитов после культивирования в среде ТС-119 с 10% фетальной бычьей сыворотки, 50 нг/мл пролактина, 50 мкг/мл гентамицина совместно с 1×106 клеток гранулезы на мл среды в течение 24 часов.  Предварительно исходная популяция донорских ооцитов из яичников животных подвергалась ВСВ-тесту с целью оценки функционального статуса. Для этого ооцит-кумулюсные комплексы помещали в  раствор бриллиантового кристаллического голубого — ВСВ (B-5388, Sigma) в концентрации 13 Mm на 60 минут при температуре 38,50С в атмосфере 90% влажности. По истечении времени воздействия ВСВ ооциты ранжировали на: ооциты с голубой окраской цитоплазмы — ВСВ+(ооциты, завершившие фазу роста) и неокрашенные ооциты (без голубой окраски цитоплазмы) — ВСВ(растущие ооциты). Обнаружено, что функциональный статус (растущие или завершившие фазу роста) ооцитов и их происхождение (диаметр фолликулов из которых выделяли гаметы) детерминируют их потенции к индуцированному партеногенезу. Завершившие фазу роста ооциты Bos Taurus обладают  высокими потенциями к индуцированному холодовым шоком партеногенезу, что выражается в значительном росте доли развившихся из них эмбрионов на всех стадиях доимплантационного развития (процент дробления — 87% против 11%, P<0,001; выход поздних морул бластоцист - 32% против 6%, P<0,001).  Мониторинг показателей компетентности к партеногенезу ооцитов BosTaurus, выделенных из фолликулов разного диаметра (< 3мм, 3 мм -5 мм, >5 мм-8 мм), выявил низкие потенции к индуцированному холодовым шоком партеногенезу ооцитов, выделенных из фолликулов менее 3 мм в диаметре (процент дробления 20% против 67% и 87%, P<0,001, соответственно; выход поздних морул бластоцист – 9% против 22% и 37%, P<0,001, соответственно).

COMPETENCE TO INDUCED PARTENOGENESIS OF BOS TAURUS OOCYTES, DEPENDING ON THE GAMETE FUNCTIONAL STATUS AND ITS ORIGIN (FOLLICLE DIAMETER)

T. KUZMINA 1, H. ALM 2

Abstruct. The development of effective methods for obtaining parthenogenetic embryos is currently being considered in a new perspective as a promising technology for creating homozygous lines of embryonic stem cells, genetically identical animals. Parthenogenetic embryos of animals of different species are used as a model for studying imprinting mechanisms. In the present study, Bos Taurus parthenogenetic embryos were obtained by cold shock induction (exposure for 20 minutes at a temperature of -0 — (-4o) C) of after oocytes culture in TC-119 medium with 10% fetal bovine serum, 50 ng / ml prolactin, 50 μg / ml of gentamicin together with 1 × 106 granulosa cells per ml of medium for 24 hours. Previously, the initial population of donor oocytes from the ovaries was evaluated with BCB test to assess functional status. For this, the oocyte-cumulus complexes were placed in a solution of 13 Mm brilliant crystalline blue — BCB (B-5388, Sigma) for 60 minutes at a temperature of 38.50 C in an atmosphere of 90% humidity. After the expiration of the BCB exposure time, the oocytes were ranked as follows: oocytes with a blue cytoplasm — BCB + oocytes (oocytes that completed their growth phase) and oocytes with unpainted ooplasm — BCB oocytes (growing oocytes). It was found that the functional status (growing oocytes or oocytes that have finished growth phase) of oocytes and their origin (the diameter of the follicles from which the gametes were isolated) determine their competence for induced parthenogenesis. Oocytes that completed the growth phase have high potentials to cold shock-induced parthenogenesis, which is expressed in a significant increase in the proportion of embryos developed from them at all stages of preimplantation development (percentage of cleavage: 87% vs 11%, P <0.001; level of late morula, blastocysts: 32 % vs 6%, P <0.001). Monitoring of competency indicators to parthenogenesis of Bos Taurus oocytes isolated from follicles of different diameters (<3 mm, 3 mm -5 mm,> 5 mm-8 mm) revealed low competence to cold shock-induced parthenogenesis of oocytes isolated from follicles less than 3 mm in diameter ( the percentage of cleavage:  20% vs 67% and 87%, P <0.001, respectively; level of late morula, blastocysts: 9% vs 22% and 37%, P <0.001, respectively).

1 ВНИИГРЖ – филиал ФГБНУ «ФНЦ животноводства — ВИЖ имени академика Л. К. Эрнста»; 196601, Россия, г. Санкт-Петербург, п. Тярлево, Московское шоссе, 55а;

2 Лейбницкий Институт биологии сельскохозяйственных животных, Wilhelm-Stahl-Allee 2, 18196 Думмерсторф, Германия.